細胞實驗介紹——慢病毒建立穩轉細胞系

慢病毒包裝：公司使用3質粒慢病毒包裝系統，慢病毒系統使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，過表達慢病毒系統使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三質粒系統，將質粒混勻后使用磷酸鈣轉染方法轉染至HEK293T細胞中，培養48h后，收集上清。使用genecopo公司慢病毒顆粒純化試劑盒將慢病毒純化。6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計數所顯示出的顏色的斑點。純化后留取部分檢測病毒滴度，其余病毒凍存于-80℃冰箱中。

滴度檢測：將病毒顆粒使用梯度稀釋，分別293T細胞，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況。根據細胞熒光量計算病毒滴度。

細胞：在病毒前一天對細胞進行計數，接種約10000個細胞于12孔板中，培養過夜后使用無培養基稀釋病毒，加入12孔板中對細胞進行，病毒數量根據推薦細胞的MOI加入（若無推薦MOI，需做病毒梯度：1,5,10,50,100 5個梯度對細胞），6h后去除含病毒溶液，加入完全培養基細胞培養，培養48h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度。同時加入puromycin對細胞篩選，篩選約2周時間。從而使得研發或生產者不必以雜交瘤細胞為載體保留該，而可以以堿基序列的形式進行保存和傳播交流、鑒定。細胞篩選好后，使用定量PCR和Western blot檢測目的基因的穩定表達情況。

實驗流程：慢病毒質粒構建-HEK293T細胞培養-質粒轉染293T細胞-病毒收集-病毒純化-病毒滴度檢測-細胞-穩轉細胞篩選-穩轉細胞鑒定

結果示例：

圖 A 病毒滴度檢測；B 目的細胞病毒效果圖

大鼠主動脈內皮細胞的分離培養

方法：分離大鼠主動脈,直接貼壁于培養皿中,熒光倒置顯微鏡觀察細胞形態,免yi組化Ⅷ因子相關抗原染色鑒定細胞.結果:約24小時組織塊邊緣有游離的 新生細胞長出,7天即融合成片.消化傳代后細胞呈短梭形或三角形,單層生長,鋪路石狀,Ⅷ因子表達陽性,呈指數增殖.凍存后復蘇細胞活性均超過90%.結 論:用貼壁法成功建立了大鼠血管內皮細胞體外培養方法,凍存細胞存活率高,為體外研究提供了穩定的模型.

Q:如何避免中沉淀物的出現？

A:首先要注意正確的解凍步驟，而且溶解過程中一定要每隔一段時間均勻而緩慢的搖動。我們已經發現在下列情況下沉淀物可能增加，使用中應該盡量避免：

（1）熱滅活；

（2）在 37℃ 下培養；

（3）反復凍融；

（4）γ 射線照射；

（5）長期儲存在 2-8℃；

（6）在室溫下放置時間過長

Q:如何去除中的沉淀？

A:如想去除這些絮狀沉淀物，可以將分裝到無菌離心管中，以400g離心，上清液即可直接加入到培養基 內一起過濾。

注意：不要以過濾的方式去除這些絮狀沉淀物，因為這可能阻塞濾膜。