Southern雜交

實(shí)驗(yàn)原理

Southern印跡雜交（Southern blot）是1975年由英國人southern創(chuàng)建，是研究DNA圖譜的基本技術(shù)。Southern印跡雜交是進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的通用方法。基于第二代測序技術(shù)的miRNA測序，可以一次獲得數(shù)百萬條miRNA序列，能夠快速鑒定出不同組織、不同發(fā)育階段、不同疾病狀態(tài)下已知和未知的miRNA及其表達(dá)差異，為研究miRNA對(duì)細(xì)胞進(jìn)程的作用及其生物學(xué)影響提供了有力工具。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNAl片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNAl片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放l射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。

RNA提取及注意事項(xiàng)

研究基因的表達(dá)和調(diào)控時(shí)，需要從組織或細(xì)胞中分離純化RNA。RNA質(zhì)量的高低經(jīng)常影響RT-PCR、cDNA庫構(gòu)建和Northern Blot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的成敗。

主要試劑

Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。

1.

Trizol試劑含有，具有毒性和刺激性，注重操作。

2.

RNase污染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉，注重配帶手套，樣品盡可能蓋嚴(yán)。

3. 細(xì)胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全會(huì)降低后得率，因?yàn)橐徊糠諶NA會(huì)殘留在未裂解的細(xì)胞中。細(xì)胞裂解之后要看不見顆粒狀物質(zhì)（結(jié)締組織和骨除外）。在清洗和裂解細(xì)胞時(shí)在低溫下操作，防止在操作過程中釋放的內(nèi)源RNase降解了RNA。

4. 酵母和一些細(xì)菌由于細(xì)胞壁的特別結(jié)構(gòu)，可以加入Trizol試劑同時(shí)加入無RNase的玻璃珠并劇烈振蕩，使細(xì)胞裂解充分。

2-8℃ 避光保存一年。

在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使其終濃度為0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二焦碳酸酯為活性很強(qiáng)的物，須在通風(fēng)櫥中小心使用）

將待處理的塑料制品放入一個(gè)可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通風(fēng)柜中37℃ 或室溫下處理過夜。

將DEPC-H2O小心倒入廢液瓶中，將裝有DEPC- H2O 處理過的塑料制品的容器以鋁箔封口，高溫高壓蒸汽滅菌至少30分鐘。

滅菌塑料制品烘烤干燥，置潔凈處備用。

玻璃和金屬物品250 ℃烘烤3小時(shí)以上。