2分鐘前 浙江PCR實驗室服務(wù)至上 南京英瀚斯[英瀚斯2eefa30]內(nèi)容：ELISA 是一種結(jié)合抗原、抗ti特異性反應(yīng)和酶對底物高xiao催化作用的高敏感性免yi學(xué)實驗技術(shù)。(1)加入12μ1的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。ELISA 的基礎(chǔ)是抗原或抗ti的固相化及抗原或抗ti的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗ti仍保持其免yi學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗ti既保留其免yi學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標(biāo)本(測定其中的抗ti或抗原)與固相載體表面的抗原或抗ti起反應(yīng)，洗滌使固相載體上形成的抗原抗ti復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開，再加入酶標(biāo)記的抗原或抗ti，通過反應(yīng)使其結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶含量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

操作步驟

1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

1QPCR buffer

5 μl

dNTP mix( 2mM )

4 μl

引物1(10pM)

μl 2

引物2 ( 10pM)

2μl

Taq酶(2U/ul)

1 μl

DNA模板( 50ng-1μg/μl )

1 μl

加ddH2O至

μl 50

視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。

2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上執(zhí)行擴增。-般:在93°C

預(yù)變性3-5min ,進(jìn)入循環(huán)擴增階段: 93°C 40s→58°C 30s→72°C 60s ,循環(huán)30-35

次，后在72°C保溫7min。

3.結(jié)束反應(yīng), PCR產(chǎn)物放置于4°C待電泳檢測或-20°C長期保存。

4. PCR的電泳檢測:如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100ul進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以

除去石蠟油;否則,直接取5- 10μl電泳檢測。

STR檢測

短串聯(lián)重復(fù)(Short tandem repeats, STR)，又稱微wei星DNA(Microsatellite DNA)或簡單重復(fù)序列(Simple repeat sequence, SRS或SSR)，是廣泛存在于原核生物和真核生物基因組中的核苷酸重復(fù)序列。用新一代高通量測序技術(shù)對某物種的特定組織或細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，與參考基因組比較，可以得到基因表達(dá)差異、可變剪接、融合基因等遺傳調(diào)控信息。有絲分裂過程中DNA鏈之間的錯配引起的fu制滑動被認(rèn)為是導(dǎo)致STR產(chǎn)生的較為常見原因，并且依據(jù)不同fu制單元大小的不同以及不同物種之間，fu制滑動發(fā)生的概率也不相同。

STR是以序列 (core repeat units) 首尾相連多次重復(fù)形成。98C變性2min后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96C10s，50C5s，60°C4min，25個循環(huán)，擴增結(jié)束后設(shè)置4C保溫。每個STR的序列結(jié)構(gòu)相同，長度為2-6bp，但其重復(fù)單位數(shù)目和重復(fù)區(qū)域的長度不同，因此STR在不同種族、不同人群之間的分布具有差異性，構(gòu)成了STR遺傳多態(tài)性。不同個體之間在一個同源STR位點的重復(fù)次數(shù)也不同，因而同指紋識別一樣，STR位點分析也可對個體進(jìn)行身份識別。通過識別個體基因組在特定位點的特定序列重復(fù)，即可創(chuàng)建其基因檔案。基于此，STR分析法已經(jīng)成為一種重要的鑒定分析方法，應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)、qin子鑒定及細(xì)胞鑒定等領(lǐng)域。