大鼠主動脈內皮細胞的分離培養

方法：分離大鼠主動脈,直接貼壁于培養皿中,熒光倒置顯微鏡觀察細胞形態,免yi組化Ⅷ因子相關抗原染色鑒定細胞.結果:約24小時組織塊邊緣有游離的 新生細胞長出,7天即融合成片.消化傳代后細胞呈短梭形或三角形,單層生長,鋪路石狀,Ⅷ因子表達陽性,呈指數增殖.凍存后復蘇細胞活性均超過90%.結 論:用貼壁法成功建立了大鼠血管內皮細胞體外培養方法,凍存細胞存活率高,為體外研究提供了穩定的模型.

大鼠gu髓間充質gan細胞的分離

操作方法

(1 )取SD大鼠( 2周齡)，頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡，移入超凈工作臺內，用大頭針固定大鼠四肢于工作臺面的泡沫板上。

(2)碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離出大鼠股骨和脛骨，剔除骨頭表面肌肉, PBS溶液沖洗兩遍。

(3 )從中間剪斷股骨和脛骨，用2ml無菌注she器吸取DMEM/F 12溶液沖出gu髓細胞多次，再用針頭吹打，吸管吸入離心管內，1000r/min離心5min，棄上清，用PBS重懸細胞。

(4 )緩慢將細胞懸液加入預先裝有5mL淋巴細胞分離液的15mL離心管內，保持細胞懸液在淋巴細胞分離液上層，注意不要攪動液面,保持二者分層界面。

(5 ) 2000rpm離心15-25min，離心后溶液分4層，吸取中間骨sui基質細胞層(白色渾濁狀)， PBS洗三次。

(6)用含15%胎牛xue清及青鏈mei素的DMEM/F 12以106/mL的細胞濃度接種于25cm2培養瓶中， 置37°C、5%CO2恒溫培養箱中培養。

( 7 ) 24小時后棄去培養液(看細胞貼壁情況)，PBS沖洗2-3次去除末貼壁細胞，加入培養液繼續培養。以后每3d半量換液1次，-般10d細胞生長融合。

(8 )經0.25%胰酶消化，1 : 2傳代，其后一般3-5d傳代1次,選取生長良好的第三代細胞進行后續實驗。

大鼠脂肪的分離

將手術切取的大鼠脂肪組織盡量剪碎后移至離心管，其余步驟與人脂肪的分離一致。

經手術切除獲得的大鼠皮下脂肪組織消化后原代培養24 h，且肉眼觀察會發現培養瓶底部貼附著一層網狀薄膜，輕輕搖晃培養瓶可使這層網狀薄膜從瓶壁上脫落，鏡下觀 察發現大部分細胞都附著于這層膜上，通過術獲取的人脂肪組織消化后則無此現象。增加膠原酶的量和消化時間也無法避免，取材時的或脂肪間結締組織未被完全消化，穿過細胞篩進入了培養瓶并沉淀于瓶底部形成的。膠原蛋白酶雖然可以特異性水解膠原蛋白的三維螺旋結構，但不會損傷其他蛋白質。處理方法是37 ℃下用胰蛋白酶 消化5 min。處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外--組剪刀、鑷子剪開腹部肌層，露出，后用第三組剪刀和鑷子將小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。然后利用40 μm的細胞篩過濾后傳代。 根據作者的經驗，每毫升手術切除的大鼠脂肪可分離基質血管成分細胞約1.81×106個。原代培養2.24×10^7個大鼠基質血管成分細胞，40 h后傳代時約剩余 6.2×10^6個細胞，細胞剩余率27%。