血管生成技術

一、服務介紹

zhong瘤血管生成是一個極其復雜的過程，一般包括包括血管內皮基質降解、內皮細胞移行、內皮細胞增殖、內皮細胞管道化分支形成血管環和形成新的基底膜等步驟。6．加入辣根過氧化物酶結合的親合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min。由于zhong瘤組織這種新生血管結構及功能異常，且血管基質不完善，這種微血管容易發生滲漏，因此腫liu細胞不需經過復雜的侵襲過程而直接穿透到血管內進入血流并在遠隔部位形成轉移。

血管生成（Angiogenesis）是指源于已存在的mao細血管和毛xi血管后微靜脈新的mao細血管性血管的生長。置于37目，5%CO2的細胞培養箱中培養2-3周，計數含50個細胞以上得克l隆，計算細胞集落形成率，Spotll采集圖像。無論原發性zhong瘤還是繼發性zhong瘤，一旦生長直徑超過1~2 mm，都會有血管生成。這是由于zhongt瘤細胞自身可分泌多種生長因子，誘導血管生成。

三、自噬過程進行觀察和檢測

1、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢。從而使得研發或生產者不必以雜交瘤細胞為載體保留該，而可以以堿基序列的形式進行保存和傳播交流、鑒定。自噬體(AV1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體(AV2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo AV )

2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時長，不利于監測(Monitoring) 自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發生聚集的現象開發出了此技術。3D細胞培養3D多細胞腫liu球是在體外應用組織培養方法使腫liu細胞以多細胞集聚體的形式生長成為具有三維結構的球體。無自噬時，GFP-LC3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。

3、利用Western Blot檢測LC3-II/比值的變化以評價自噬形成自噬形成時，胞漿型LC3 (即 LC3-I)會酶解掉一小段多肽，轉變為(自噬體)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估計自噬水平的高低。一般流程：細胞收集-70%酒精固定過夜-PI染色-流式細胞儀檢測。(注意: LC3對LC3-II有更高的親和力，會造成假陽性。方法2和3需結合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。)

4、MDC (Monodansylcadaverine ，單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。

小鼠成骨細胞和破骨細胞共培養模型的建立

細胞之間的相互調控作用奠定基礎.方法利用24 h內新生小鼠顱骨和4~8周齡成年小鼠四肢長分別分離、培養成骨細胞和破骨細胞，采用間接接觸的培養模式將接種了骨sui單核細胞的玻片或骨片置入提前24 h接種了成骨細胞的培養皿中進行共培養.共培養-定時間后進行破 骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP染色鑒定和骨吸收功能檢測，并進一 步采用RT- PCR對破骨細胞標志酶基因基質金屬蛋白酶.9(MMP-9)、TRAP 和組織蛋白酶K (Cathepsin K )的表達進行檢測結果共培養5天后可觀TRAP(+)多核細胞形成13天TRAP(+ )多核細胞數目達到高峰;骨吸收陷窩在共培養7天后開始出現,隨著培養時間的延長,陷窩面積呈增加趨勢;破骨細胞標志基因TRAP在共培養3天時開始表達，而MMP-9和Cathepsin K則在共培養5天后表達結論共培養體系中成骨細胞對破骨細胞調控作用顯著誘導的破骨細胞具有噬骨能力，該共培養模型可用于成骨細胞和破骨細胞之間的相互調控作用研究.

軟瓊脂培養克l隆形成試驗基本步驟:

(1)取對數生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活l細胞計數，用含20%胎牛血l清的DMEM培養液調整細胞密度至1x106細胞/L。然后根據實驗要求作梯度倍數稀釋。

(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40日中不會凝固。

(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2xDMEM培養基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7~ 10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。

(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2xDMEM培養基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37回5%CO2溫箱中培養10~14天。

(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞數。計算形成率。(3)PBS緩沖液充分漂洗軟gu小塊3次，然后用小剪刀將軟gu塊切碎至約Imm3大小。軟瓊脂培養法常用檢測腫l瘤細胞和轉化細胞系。試驗中瓊脂與細胞相混時，瓊脂溫度不宜超過40日。接種細胞的密度每平方厘米不超過35個，一般6cm的平皿接種1000個細胞。正常細胞在懸浮狀態下不能增殖，不適用于軟瓊脂克l隆形成試驗。

軟瓊脂集落形成率實驗(軟瓊脂克l隆)

將1.2%低熔點瓊脂糖與2x細胞培養基以1:1的體積比混合制備0.6%的底層瓊脂，6孔板中每個孔1.4ml溫室凝固，取對數期細胞，胰酶消化后吹散成單個細胞懸液，計數，并調細胞濃度為10000個/ml，將0.6%低熔點瓊脂糖與2x細胞培養基以1:1的體積比混合，制備0.3%的上層瓊脂，每孔加1ml 上層瓊脂和100ul單細胞懸液(約1000ell/wel)， 混勻，室溫凝固。(2)碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離出大鼠股骨和脛骨，剔除骨頭表面肌肉,PBS溶液沖洗兩遍。置于37目，5%CO2的細胞培養箱中培養2-3周，計數含50個細胞以上得克l隆，計算細胞集落形成率，Spotll 采集圖像。