成纖維細(xì)胞分離方法

1.處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外- -組剪刀、鑷子剪開腹部肌層，露出，后用第三組剪刀和鑷子將小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。

2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內(nèi)臟，將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS,再重復(fù)此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到另- -裝有D-PBS的平皿中，并用手術(shù)刀片將其細(xì)細(xì)切碎。接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過35個(gè)，一般6cm的平皿接種1000個(gè)細(xì)胞。

3. 用200 μ的移液反復(fù)、快速地吹打平皿中的液體，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，于4C 1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10 ml胰酶重懸沉淀，放在37C水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化。

4.將上層細(xì)胞懸液倒入一個(gè)裝有10 ml MEF生長培養(yǎng)基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網(wǎng)過濾后，以1500 rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，再用30 ml MEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次。

5.細(xì)胞沉淀用15 ml MEF生長培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(- -般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細(xì)胞)。

6. 3x106細(xì)胞懸浮于15 ml MEF生長培養(yǎng)基中，接種到200 ml培養(yǎng)瓶中。

7. 24小時(shí)后更換新鮮的MEF生長培養(yǎng)基。

8.細(xì)胞長滿后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化(此步時(shí)間不宜過長，作者- -般不超過五分鐘)，按1:5傳代。

9. 細(xì)胞再次長到覆蓋率80-90%左右， 將其消化后，常規(guī)凍存(凍存液要現(xiàn)配)。

脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

1、細(xì)胞H9C2 (Hela) 6孔板Hela1x10°/孔。

2、轉(zhuǎn)染前換上沒有抗sheng素的DMEM+胎清(10%)。

3、將質(zhì)粒DNA (約2-4ul) 2ul 加入dorf管中+DMEM至50u1。

4、脂質(zhì)體5ul補(bǔ)培養(yǎng)基至50ul混勻靜止5分鐘(質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例為1:2或1.5:2.5)。

5、將含有脂質(zhì)體的培養(yǎng)基與含質(zhì)粒的混合總體積100ul室溫放置30分鐘。

6、吸取混合物均勻加入每一個(gè)孔中。

7、將6孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后吸出培養(yǎng)基換上新配置的培養(yǎng)基DMEM6ml+胎清600u1+三抗300u1。

8、培養(yǎng)24小時(shí)。

目的

學(xué)習(xí)和掌握外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的主要方法——脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。了解外源基因進(jìn)入的一般性方法，觀測外源蛋白的表達(dá)（綠色熒光蛋白），為染色準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料。

實(shí)驗(yàn)原理

上圖所示是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的示意圖，它顯示了外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的一般過程。

外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。干細(xì)bao培養(yǎng)誘導(dǎo)分化干細(xì)bao是一類具有自我更新、高度增殖和多項(xiàng)分化潛能的細(xì)胞，理論上具有無限分裂能力，在特定條件下，可分化成特定組織。法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于法和磷酸鈣法的實(shí)驗(yàn)條件控制較嚴(yán)、難度較大；病毒法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對于細(xì)胞有較大影響；所以現(xiàn)在對于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長短和培養(yǎng)基中的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題，通過實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對于效率的提高有巨大的作用。

關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的常見問題

Q：培養(yǎng)液到底要不要加雙抗（青&鏈）？

A：雙抗不是細(xì)胞生長必需的。我們培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)不常規(guī)使用，因?yàn)檫B續(xù)使用會促進(jìn)耐藥性細(xì)胞株的產(chǎn)生，導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在。一旦將從培養(yǎng)液中去除，這種輕度污染終將發(fā)展成為大規(guī)模污染。具體情況，可根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境，自行決定是否使用雙抗。

Q：細(xì)胞培養(yǎng)，能更換成其它種類的培養(yǎng)基嗎？

A：我們強(qiáng)烈建議好使用細(xì)胞提供機(jī)構(gòu)或細(xì)胞庫推薦的生長培養(yǎng)液。有些細(xì)胞可能會適應(yīng)在不同培養(yǎng)基中生長，在做好保種的條件下，可以分出部分細(xì)胞做測試。