分子實驗介紹——熒光定量PCR檢測

熒光定量PCR是檢測生物樣品中RNA含量的普遍的方法，通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。目前主要使用Sybr green和taqman法對RNA含量進行檢測。Sybr green在低樣本量時成本較低，目前選用的較多。當重組病毒載體導入包裝細胞后，缺陷病毒載體和包裝細胞的互補作用共同完成病毒裝配，該病毒顆粒可其它宿主細胞，此時目的基因進入該細胞并整合到細胞基因組中，導致插入序列在宿主細胞中表達，產生目的蛋白。

SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結合的熒光染料。當它與DNA雙鏈結合時，發出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應，當SYBR Green染料與DNA雙鏈結合時發出熒光。2、DNA變性時，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產物結合，定量PCR系統檢測到熒光的凈增量加大。ELISA是一種結合抗原、抗ti特異性反應和酶對底物高xiao催化作用的高敏感性免yi學實驗技術。

實驗流程：細胞或組織RNA提取-RNA濃度檢測-RNA逆轉錄-定量PCR檢測。

結果示例：

圖 A 基因擴增曲線圖；B 基因擴增溶解曲線圖；C mRNA相對表達量變化

從圖中可以擴增曲線可以看出目的RNA擴增效果，溶解曲線可以看出引物識別特異性情況，通過使用ΔΔCt方法計算可以得到每個組中目的mRNA表達變化。

腺病毒包裝原理介紹

腺病毒是一種沒有包膜的直徑為79-90nm的顆粒，由252個 殼粒呈二十面體排列構成。每個殼粒的直徑為7-9nm。衣殼里是線狀雙鏈DNA分子，兩端各有長約100bp的反向重復序列。microRNA通過和靶基因mRNA堿基配對引導沉默復合體（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而在轉錄后水平調控蛋白表達（新發現miRNA也能在轉錄水平調控基因表達）。人體腺病毒 已知有33種，分別命名為ad1-ad33，研究詳細得是ad2.

腺病毒是一種無包膜的球型結構的病毒，遺傳物質為線型 雙股DNA形式。腺病毒的特點：（1）gan染范圍廣對人致病性低；（2）對增殖和非增殖細胞均具有gan染性；（3）能有效進行增殖；（ 4）病毒滴度高；（5）不整合到染色體中，無插入致突變性；(6)外源基因裝載容量大。如測序序列已知，可通過序列比較以星號標出差異堿基處，提高工作效率。由于腺病毒的這些特點使其廣泛地應用于體 外基因轉導、體內接種yi苗、和基因zhi療等各個領域。

實驗方法

1.獲得目的基因序列；

2.構建病毒表達載體質粒；

3.表達載體質粒和包裝質粒重組；

4.gan染HEK293，包裝出病毒；

5.病毒擴增、濃縮；

6.滴度測定。

RNA酶（Rnase）是導致RNA降解主要的物質。此酶非常穩定，在一些的條件下只可暫時失活，但限制因素去除后又迅速恢復活性。常規高溫高壓滅菌方法和蛋白抑制ji不能使所有的Rnase完全失活。

1.它廣泛存在于人的皮膚上，因此制備RNA時必須戴手套

2.RNase的又一污染源是取液器。根據取液器制造商的要求對取液器進行處理。一般情況下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內部和外部，可基本達到要求。

3. 塑料制品、玻璃和金屬物品的處理

（1）塑料制品：盡量使用一次性無菌塑料制品。已標明RNase-free的塑料制品，如沒有開封使用過，通常不必再處理。

注意事項

1. 為了避免蛋白質變性，不要對樣品劇烈攪動和反復凍融。

2. 緩沖溶液成分盡量模擬細胞內環。。

3. 為了避免蛋白質的氧化，將 0.1～1 mmol/LDTT（二硫蘇糖醇）(或 β-巰）加入到緩沖溶液中。

4. 為了避免重金屬對目標蛋白的破壞，將 1～10 mmol/LEDTA 金屬螯合劑加入。

5. 為了避免微生物生長，使用滅菌溶液。在純化任何一種蛋白質的時候，均必須時刻對它的穩定性注意維護，使它的活性得到保護，需要牢記如下一些通用的注意事項。

6. 盡可能置于冰上或者在冷庫內進行操作。

7. 蛋白濃度不要太稀。

8. 除非是進行聚焦層。否則 pH 需要合適，防止所使用的緩沖溶液 pH 與 pI 相同，使蛋白質的沉淀得以避免。

9. 使用蛋白酶，避免蛋白酶對目標蛋白的降解；在純化細胞中的蛋白質時，將 DNA 酶加入來使得 DNA 降解，避免 DNA 對蛋白的污染。