大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)

方法：分離大鼠主動脈,直接貼壁于培養(yǎng)皿中,熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),免yi組化Ⅷ因子相關(guān)抗原染色鑒定細(xì)胞.結(jié)果:約24小時組織塊邊緣有游離的 新生細(xì)胞長出,7天即融合成片.消化傳代后細(xì)胞呈短梭形或三角形,單層生長,鋪路石狀,Ⅷ因子表達(dá)陽性,呈指數(shù)增殖.凍存后復(fù)蘇細(xì)胞活性均超過90%.結(jié) 論:用貼壁法成功建立了大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法,凍存細(xì)胞存活率高,為體外研究提供了穩(wěn)定的模型.

大鼠gu髓間充質(zhì)gan細(xì)胞的分離

操作方法

(1 )取SD大鼠( 2周齡)，頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡，移入超凈工作臺內(nèi)，用大頭針固定大鼠四肢于工作臺面的泡沫板上。

(2)碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離出大鼠股骨和脛骨，剔除骨頭表面肌肉, PBS溶液沖洗兩遍。

(3 )從中間剪斷股骨和脛骨，用2ml無菌注she器吸取DMEM/F 12溶液沖出gu髓細(xì)胞多次，再用針頭吹打，吸管吸入離心管內(nèi)，1000r/min離心5min，棄上清，用PBS重懸細(xì)胞。

(4 )緩慢將細(xì)胞懸液加入預(yù)先裝有5mL淋巴細(xì)胞分離液的15mL離心管內(nèi)，保持細(xì)胞懸液在淋巴細(xì)胞分離液上層，注意不要攪動液面,保持二者分層界面。

(5 ) 2000rpm離心15-25min，離心后溶液分4層，吸取中間骨sui基質(zhì)細(xì)胞層(白色渾濁狀)， PBS洗三次。

(6)用含15%胎牛xue清及青鏈mei素的DMEM/F 12以106/mL的細(xì)胞濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中， 置37°C、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

( 7 ) 24小時后棄去培養(yǎng)液(看細(xì)胞貼壁情況)，PBS沖洗2-3次去除末貼壁細(xì)胞，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。以后每3d半量換液1次，-般10d細(xì)胞生長融合。

(8 )經(jīng)0.25%胰酶消化，1 : 2傳代，其后一般3-5d傳代1次,選取生長良好的第三代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

大鼠脂肪的分離

將手術(shù)切取的大鼠脂肪組織盡量剪碎后移至離心管，其余步驟與人脂肪的分離一致。

經(jīng)手術(shù)切除獲得的大鼠皮下脂肪組織消化后原代培養(yǎng)24 h，且肉眼觀察會發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶底部貼附著一層網(wǎng)狀薄膜，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶可使這層網(wǎng)狀薄膜從瓶壁上脫落，鏡下觀 察發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞都附著于這層膜上，通過術(shù)獲取的人脂肪組織消化后則無此現(xiàn)象。增加膠原酶的量和消化時間也無法避免，取材時的或脂肪間結(jié)締組織未被完全消化，穿過細(xì)胞篩進(jìn)入了培養(yǎng)瓶并沉淀于瓶底部形成的。膠原蛋白酶雖然可以特異性水解膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，但不會損傷其他蛋白質(zhì)。磁性細(xì)胞標(biāo)記方式應(yīng)用MACS技術(shù)進(jìn)行磁性細(xì)胞分選重要的一點(diǎn)是高質(zhì)量的標(biāo)記。處理方法是37 ℃下用胰蛋白酶 消化5 min。然后利用40 μm的細(xì)胞篩過濾后傳代。 根據(jù)作者的經(jīng)驗(yàn)，每毫升手術(shù)切除的大鼠脂肪可分離基質(zhì)血管成分細(xì)胞約1.81×106個。原代培養(yǎng)2.24×10^7個大鼠基質(zhì)血管成分細(xì)胞，40 h后傳代時約剩余 6.2×10^6個細(xì)胞，細(xì)胞剩余率27%。